LAPORAN PRAK GENETIKA DASAR ISOLASI DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Percobaan isolasi DNA tanaman dan hewan perlu dilakukan karena isolasi DNA sendiri merupakan teknik esensial dalam biologi molekuler. Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen ( Surzycki, 1936 ).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. ( Surzycki, 1936 ). Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian  dari metode isolasi DNA.

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma. ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda pada dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA dari tanaman dan hewan untuk mengetahui DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Dan Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleus yang terbungkus membran ( Albert, 1994 )                                                                                                                                                                                                                                                                               

1.2 Tujuan

-          Untuk mengetahui cara/ metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari bauh-buahan.

-          Untuk mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf  2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup.

Fungsi-fungsi tersebut adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava dkk. 2004:220).
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).

           DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya.

Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce 2005:203).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).

Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya ≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal. Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa lebih lanjut menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis.

Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. (Kirsman, 2010)

BAB III

METODE

3.1.Waktu dan Tempat

          Praktikum dilaksanakan pada hari Rabu, tanggal 5 Desember 2012 di laboratorium fisiologi Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarifhidayatullah Jakarta.

3.2.Alat dan bahan

          Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah: beaker glass, pisau, pengaduk, mesin blender, spatula, tabung reaksi, labu erlenmeyersaringan, dan kertas saring.

          Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah buah mangga, pepaya, nanas,tomat, sayur bayam, wortel, sabun cair, detergen, aquades, garam dapur, alkohol 96%, dan enzim papain.

3.3.Cara kerja

Pertama disiapkan sabun cair atau detergen yang telah dicairkan dengan air secukupnya, kemudian buah dan sayur yang telah dipotong ditimbang hingga 75-85 gram dan ditambah 200 ml aquades dingin dan 1gram garam dapur. Lalu bahan tersebut diblender selama 30 detik – 1 menit.

          Setelah itu jus buah atau sayur disaring dengan saringan biasa lalu disaring kembali dengan menggunakan kertas saring. Setelah didapat hasil saring ditambah dengan 15 ml sabun cair atau detergen dan di aduk hingga homogen, kemudian diamkan selama 10-15 menit.

          5 ml larutan jus yang telah disaring dan ditambah sabun cair diambil dan dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambah 0,05 gram enzim papain dan diaduk sampai homogen, kemudian didiamkan selama 3 - 5 menit.

         

          Setelah 5 menit, ditambahkan 5ml alkohol 96% secara perlahan, kemudian diamati DNA yang terbentuk. Dan yang perlu diperhatikan pada proses timbulnya DNA  yaitu waktu yang diperlukan atau lama waktu munculnya DNA, warna DNA, serta banyak atau sedikitnya DNA yang terbentuk.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada praktikum isolasi DNA tumbuhan kali ini, langkah pertama yang dilakukan adalah dengan menghancurkan sampel yang akan diuji dengan alat penghancur atau blender dan ditambahkan dengan garam. Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke dalam organel-organel sel, dalam hal ini targetnya adalah inti sel (untuk mengambil DNA nya). Dibantu dengan tambahan garam yang membuat kondisi air menjadi hipertonis sehingga mempermudah lisisnya dinding sel.

Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring, ini berfungsi untuk memisahkan serat-serat yang kasar dengan yang halus, sehingga didapatkan sampel berupa cairan yang tidak terlalu kental. Kemudian larutan yang didapat ditambahkan dengan 15 ml sabun cair dengan konsentrasi 20%, sabun cair ini berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari sabun cair sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.

Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya di beri enzim papain. Enzim ini berasal dari buah papaya. Pemberian enzim papain ini berfungsi untuk melunakan dinding sel dan menghancurkan membran inti sel, sehingga DNA yang terdapat di dalam membrane inti akan terurai keluar. Lalu sampel tersebut ditambahkan dengan alkohol 96%, alkohol ini berfungsi untuk membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah keluar dari sel atau memisahkan bagian-bagian yang terurai tersebut berdasarkan berat molekul.

 

                                                                                                  

                                                                          1

                                                                           2                     

                                                                          

                                                                           3

Gambar 1. Endapan yang terbentuk dari buah pepaya, beberapa detik setelah pemberian alkohol 96%. Keterangan gambar = 1. RNA, 2. DNA, 3. Protein. Dokumentasi pribadi.

Setelah beberapa detik timbul endapan pada sampel. Waktu yang dibutuhkan sampel untuk membentuk endapan berbeda-beda. Berikut grafik waktu yang dibutuhkan oleh masing-masing sampel :

 

Diagram 1. Perbandingan waktu yang dibutuhkan oleh sampel untuk membentuk endapan.

 

Gambar 2. Hasil isolasi DNA tumbuhan dari jumlah enam sampel (kiri ke kanan), tomat, wortel, nanas, papaya, bayam dan mangga. Dokumentasi pribadi.

Berdasarkan diagram catatan waktu, waktu tersingkat yang dibutuhkan untuk proses presipitasi adalah pada sampel buah pepaya (Carica papaya). Ini dimugkinkan karena adanya kandungan enzim papain yang dikandung dalam papaya, yang menyebabkan kandungan enzim papain di dalam buah pepaya lebih banyak daripada di sampel buah yang lain. Sehingga reaksi pengendapan yang terjadi pada pepaya membutuhkan waktu yang sangat singkat dibandingkan dengan sampel yang lain, yaitu sekitar 44 detik. Hal yang berkebalikan terjadi pada bayam (A. spinosus), waktu yang dibutuhkan bayam untuk membentuk endapan adalah 420 detik atau 7 menit.

Kemudian dari hasil endapan yang terbentuk (Gambar 1), endapan yang paling bawah adalah protein, yang melayang adalah DNA dan yang mengapung adalah RNA. Perbedaan letak ini disebabkan adanya perbedaan berat molekul yang dikandung masing-masingnya. Dilihat dari susunannya, protein memang lebih berat. Karena protein merupakan makromolekul yang disusun oleh 20 jenis asam amino dan asam amino inilah yang dibentuk dari kumpulan-kumpulan DNA yang berpilin.

 

Gambar 3. Susunan protein yang terdiri dari 20 jenis asam amino. sciencebiotech.net

Kemudian di dapat DNA yang terletak di tengah-tengah tabung atau melayang. DNA yang dihasilkan berupa benang-benang putih. Lalu RNA yang mengapung paling atas. Ini berarti berat molekul dari yang teringan sampai terberat adalah RNA, DNA dan Protein.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. DNA akan terlihat sebagai massa (benang-benang) yang berwarna putih dan perlahan-lahan naik ke permukaan tabung
2. Enzim papain terdapat pada buah pepaya yang berfungsi sebagai pelunak untuk daging
3. Enzim bromelin yang terdapat pada buah nanas berfungsi sebagai membantu memecah protein
4. Untuk mengisolasi DNA pada buah diperlukan langkah yang sistematis, yaitu menghancurkan dinding sel dengan penggerusan bahan (manual,dan kimia), melisiskan membrane sel dan membrane nucleus dengan pencampuran detergen , serta presipitasi DNA dengan penambahan ethanol dan Nacl dari garam.
5. Kesulitan melihat massa putih pada tabung , disebabkan oleh detergen , dalam hal ini sunlight cair berwarna hijau yang terlalu kental, sehingga warna hijau menjadi sangat mendominasi

DAFTAR PUSTAKA

Achmad, Wendy. 2010. Isolasi DNA.

Albert, B,et al. 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama

Anonim a. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ, (Online), (http://www.gslc.genetics.utah.edu/units/activities/wheatgerm.html. (Diakses 9 Desember 2012)

Campbell, N.A., L.G. Mitchell and J.B. Reece. 2004. Biology: Concept and Connections. The Benjamin/Cummings Pub. Co., Inc.

Elrod, S, Stansfield, W. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga

Hays, Lana. 2005. Introduction to DNA Extraction, (Online), http://www.tsl.orst.edu.tgerc/dnaext.html. (Diakses 9 Desember 2012)

Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta : Sagung Seto

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang

Kirsman. 2010. Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com/2/post/2010/01/isolasi-dna-buah.html (Diakses tanggal 9 Desember 2012)

Pierce A.G.& Neil R.B. 2005. At A Glance Ilmu Bedah. Jakarta : Erlangga.

Raven and Johnson. 2002. Biology 6 Edition. www.simpopdf.com (Diakses tanggal 9 Desember 2012)

Russell, P.J. 1994. Foundamental of Genetics. Harper Collins College Publishers. New York: xiii + 528 hlm.

Sadava, D. 2004. Life: The Science of Biology. 5th ed. Sinauer Associates, Inc.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.

Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta : UGM Press

Surzycki, S. 1936. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

Lampiran

Pertanyaan

1. Apa fungsi garam dapur, deterjen, dan alkohol 96 %?

            Jawab : Garam dapur berfungsi untuk membuat keadaan air hipertonis dan memudahkan sel memisahkan diri. Deterjen berfungsi untuk merusak membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak. Alkohol 96 % berfungsi untuk membentuk endapan / terjadinya presipitasi.

2. Sebutkan cara atau bahan sederhana/ yang mudah didapat untuk mengisolasi DNA selain bahan diatas!

Jawab :